La Galleria deve la sua vasta popolarità alla presenza di alcune sculture di Michelangelo: i Prigioni, il San Matteo e in particolare il celebre David, qui trasportato nel 1873, per il quale venne realizzata la scenografica galleria.
Nei locali contigui, ricavati da due antichi conventi, sono state raccolte, a partire dall’Ottocento, importanti opere d’arte provenienti dall’Accademia del Disegno, dall’Accademia di Belle Arti e da conventi soppressi.
Si tratta in gran parte di dipinti di soggetto religioso eseguiti dai maggiori maestri operanti a Firenze e nei dintorni dalla seconda metà del Duecento alla fine del Cinquecento. In particolare la collezione di tavole a fondo oro è unica al mondo. Nelle sale del primo piano si può ammirare un insieme di grandiosi polittici tardo gotici, pervenuti integri di ogni parte.
Da segnalare inoltre la gipsoteca di due scultori dell’Ottocento: Lorenzo Bartolini e Luigi Pampaloni, e la raccolta di icone russe.
Recentemente la Galleria si è arricchita con il Dipartimento degli Strumenti Musicali, che comprende antichi, importanti strumenti del Conservatorio Luigi Cherubini, provenienti dalle collezioni medicee e lorenesi.