Trovano qui posto i dipinti più antichi della raccolta della Galleria, risalenti al secolo XIII e ai primi anni del XIV. I dipinti, tutti eseguiti su tavola secondo la pratica in uso in Italia fino alla fine del XV secolo, provengono da chiese e conventi toscani, soprattutto fiorentini.

La sala offre una selezione delle principali tipologie dei dipinti di soggetto religioso in uso in età tardomedievale: la Croce dipinta con l'immagine di Cristo crocifisso, che di solito sovrastava l'altare maggiore della chiesa, le icone dedicate alla Vergine, oggetto di grande devozione presso i fedeli e per questo spesso sistemate su altari laterali accessibili anche ai laici, i dossali istoriati raffiguranti l'immagine e le gesta dei santi, che svolgevano una funzione didattica, oltre che devozionale.

Accanto a queste opere, è esposta una grande tavola di Pacino di Buonaguida raffigurante l'Albero della vita , dipinto che trovava posto all'interno del convento delle clarisse di Monticelli, a Firenze. La tavola raffigura Cristo crocifisso ad una croce avente l'aspetto di un albero, l'albero della salvezza. Le radici affondano in un monte simboleggiante il Calvario, ai lati del quale sono le storie della Genesi, dalla Creazione alla cacciata di Adamo ed Eva dal paradiso. Nei tondi che, come frutti, pendono dai rami dell'albero della Vita sono invece raffigurate le storie della vita di Cristo.